CRISPR/Cas9（規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)蛋白9）核酸酶表達(dá)載體屬于幾種新興的基因組編輯工具之一（另外兩種是ZFN和TALEN），可在基因組的靶位點(diǎn)快速有效地產(chǎn)生突變。這些質(zhì)粒載體編碼的特異性RNA，能夠引導(dǎo)DNA核酸酶（或缺刻酶）編輯基因組中特定位點(diǎn)的DNA序列。

Cas9是RNA引導(dǎo)DNA核酸酶，是天然原核免疫系統(tǒng)的一部分，賦予細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)質(zhì)粒和噬菌體等外源遺傳物質(zhì)的抵抗能力。在細(xì)胞內(nèi)，Cas9核酸酶與引導(dǎo)RNA（gRNA）形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過(guò)與基因組中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA與靶位點(diǎn)通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點(diǎn)。為了方便使用，我們?cè)O(shè)計(jì)的CRISPR/Cas9載體能夠在一個(gè)載體上同時(shí)有效表達(dá)Cas9核酸酶（或缺刻酶）和引導(dǎo)RNA（gRNA）。

我們的CRISPR/Cas9表達(dá)載體中有兩種Cas9核酸酶供選擇，一種是標(biāo)準(zhǔn)的人源化Cas9（hCas9），能夠有效地在靶位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSBs）；另一種是“缺刻酶”（Cas9_D10A），僅在DNA中產(chǎn)生單鏈切割。如果將Cas9_D10A缺刻酶與靶向兩條互補(bǔ)鏈的兩個(gè)gRNA一起使用，缺刻酶會(huì)在兩條鏈上產(chǎn)生單鏈切割，從而導(dǎo)致靶位點(diǎn)處產(chǎn)生DSB。這種方法通常會(huì)減少CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)，因?yàn)樗枰獌蓚€(gè)gRNA同時(shí)靶向靶位點(diǎn)。

細(xì)胞通過(guò)非同源末端連接途徑（NHEJ）修復(fù)通常會(huì)產(chǎn)生小的片段或堿基缺失，插入和堿基置換等突變。當(dāng)這些突變破壞蛋白質(zhì)編碼區(qū)（例如引起移碼缺失）時(shí)，會(huì)引起功能性基因敲除。在少數(shù)情況下，CRISPR/Cas9載體和外源供體DNA模板共同導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞會(huì)通過(guò)同源性修復(fù)（HDR）機(jī)制來(lái)修復(fù)DSB，靶基因DNA序列會(huì)被模板序列取代，堿基發(fā)生改變，如點(diǎn)突變等。缺刻基因組DNA也會(huì)經(jīng)常發(fā)生同源修復(fù)（HDR），如將外源模板DNA與Cas9_D10A缺刻酶一起導(dǎo)入細(xì)胞中，有可能產(chǎn)生堿基改變。

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以有效靶向大部分DNA序列，而NGG（有時(shí)是NAG）是必須的。NGG叫做前間區(qū)序列鄰近基序（PAM），位于靶DNA，gRNA識(shí)別序列的3'末端。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

我們的CRISPR/Cas9表達(dá)載體可以用于快速高效靶向細(xì)胞基因組，并在靶位點(diǎn)并產(chǎn)生堿基缺失等突變。為了在特定的靶位點(diǎn)引入突變，需要與靶DNA序列匹配的gRNA序列以及核酸酶hCas9（產(chǎn)生DSB）或其變體Cas9_D10A缺刻酶（單鏈切割）。

圖1 all-in-one CRISPR系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯。（A）向穩(wěn)定表達(dá)EGFP的HEK293T細(xì)胞（HEK293T-EGFP）轉(zhuǎn)染表達(dá)Cas9:T2A:mCherry的常規(guī)質(zhì)粒和靶向EGFP的scramble gRNA。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EGFP表達(dá)水平。MFI表示熒光強(qiáng)度中值。（B）顯微鏡（100x）觀察EGFP和mCherry表達(dá)。（C）轉(zhuǎn)染all-in-one CRISPR載體的細(xì)胞對(duì)比無(wú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的相對(duì)EGFP表達(dá)。相對(duì)EGFP表達(dá)量用以下公式計(jì)算：[MFI (experimental group) – MFI (WT HEK293T cells)] / [MFI (HEK293T-EGFP cells) – MFI (WT HEK293T cells)]。Mean±SD，ns P>0.05，ANOVA以及Tukey事后檢驗(yàn)。（D）gRNA靶向的基因組DNA區(qū)域使用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，基因編輯效果使用T7E1試驗(yàn)確認(rèn)。

瞬時(shí)表達(dá)：轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9質(zhì)粒載體后，Cas9蛋白和gRNA會(huì)在靶細(xì)胞中大量瞬時(shí)表達(dá)。如果沒(méi)有藥物篩選，質(zhì)粒會(huì)隨著時(shí)間流逝而丟失，在基因組編輯發(fā)生后，靶細(xì)胞中的Cas9和gRNA也會(huì)逐漸消失。

簡(jiǎn)單易懂：gRNA和靶位點(diǎn)之間的簡(jiǎn)單同源關(guān)系使得CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡(jiǎn)單且易于設(shè)計(jì)。

具有脫靶效應(yīng)：已有文獻(xiàn)報(bào)道CRISPR/Cas9具有脫靶效應(yīng)，通常TALEN系統(tǒng)比CRISPR/Cas9具有更低的脫靶活性。通過(guò)將Cas9_D10A缺刻酶與兩種gRNA結(jié)合使用（如上所述），可以顯著減輕脫靶效應(yīng)。

PAM要求：CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)必須包含NGG序列（使用較多），也叫做PAM序列，位于gRNA識(shí)別序列3'末端。

Single-gRNA CRISPR regular plasmid vector

U6 Promoter: This drives high level expression of the gRNA. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.

gRNA: Guide RNA compatible with Cas9 derived from Streptococcus pyogenes.

Terminator: Terminates transcription of the gRNA.

CBh promoter: Chicken beta-actin promoter. Drives expression of the downstream Cas9 nuclease.

Cas protein: Cas9 nuclease variant chosen by user.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.